一、 顯微鏡的基本光學(xué)原理

　?。ㄒ唬?折射和折射率

　　光線在均勻的各向同性介質(zhì)中，兩點(diǎn)之間以直線傳播，當(dāng)通過不同密度介質(zhì)的透明物體時(shí)，則發(fā)生折射現(xiàn)象，這是由于光在不同介質(zhì)的傳播速度不同造成的。當(dāng)與透明物面不垂直的光線由空氣射入透明物體(如玻璃)時(shí)，光線在其介面改變了方向，并和法線構(gòu)成折射角。

　?。ǘ?透鏡的性能

　　透鏡是組成顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的更基本的光學(xué)元件，物鏡目鏡及聚光鏡等部件均由單個(gè)和多個(gè)透鏡組成。依其外形的不同，可分為凸透鏡(正透鏡)和凹透鏡(負(fù)透鏡)兩大類。

　　當(dāng)一束平行于光軸的光線通過凸透鏡后相交于一點(diǎn)，這個(gè)點(diǎn)稱"焦點(diǎn)"，通過交點(diǎn)并垂直光軸的平面，稱"焦平面"。焦點(diǎn)有兩個(gè)，在物方空間的焦點(diǎn)，稱"物方焦點(diǎn)"，該處的焦平面，稱"物方焦平面"；反之，在象方空間的焦點(diǎn)，稱"象方焦點(diǎn)"，該處的焦平面，稱"象方焦平面"。

　　光線通過凹透鏡后，成正立虛像，而凸透鏡則成正立實(shí)像。實(shí)像可在屏幕上顯現(xiàn)出來，而虛像不能。

　?。ㄈ?凸透鏡的五種成象規(guī)律

　　1. 當(dāng)物**于透鏡物方二倍焦距以外時(shí)，則在象方二倍焦距以內(nèi)、焦點(diǎn)以外形成縮小的倒立實(shí)象；

　　2. 當(dāng)物**于透鏡物方二倍焦距上時(shí)，則在象方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實(shí)象；

　　3. 當(dāng)物**于透鏡物方二倍焦距以內(nèi)，焦點(diǎn)以外時(shí)，則在象方二倍焦距以外形成放大的倒立實(shí)象；

　　4. 當(dāng)物**于透鏡物方焦點(diǎn)上時(shí)，則象方不能成象；

　　5. 當(dāng)物**于透鏡物方焦點(diǎn)以內(nèi)時(shí)，則象方也無象的形成，而在透鏡物方的同側(cè)比物體遠(yuǎn)的位置形成放大的直立虛象。

　　二、 光學(xué)顯微鏡的成象（幾何成象）原理

　　只有當(dāng)物體對人眼的張角不小于某一值時(shí)，肉眼才能區(qū)別其各個(gè)細(xì)部，該量稱為目視分辨率ε。在更佳條件下，即物體的照度為50~70lx及其對比度較大時(shí)，可達(dá)到1'。為易于觀測，一般將該量加大到2'，并取此為平均目鏡分辨率。

　　物體視角的大小與該物體的長度尺寸和物體至眼睛的距離有關(guān)。有公式y(tǒng)=Lε

　　距離L不能取得很小，因?yàn)檠劬Φ恼{(diào)節(jié)能力有一定限度，尤其是眼睛在接近調(diào)節(jié)能力的尤限范圍工作時(shí)，會(huì)使視力尤度疲勞。對于標(biāo)準(zhǔn)(正視)而言，更佳的視距規(guī)定為250mm(明視距離)。這意味著，在沒有儀器的條件下，目視分辨率ε=2'的眼睛，能清楚地區(qū)分大小為0.15mm的物體細(xì)節(jié)。

　　在觀測視角小于1'的物體時(shí)，要使用放大儀器。放大鏡和顯微鏡是用于觀測放置在觀測人員近處應(yīng)予放大的物體的。

　?。ㄒ唬?放大鏡的成像原理

　　表面為曲面的玻璃或其他透明材料制成的光學(xué)透鏡可以使物體放大成像，光路圖如圖1所示。位于物方焦點(diǎn)F以內(nèi)的物AB，其大小為y，它被放大鏡成一大小為y'的虛像A'B'。

　　放大鏡的放大率

　　Γ=250/f'

　　式中250--明視距離，單位為mm

　　f'--放大鏡焦距，單位為mm

　　該放大率是指在250mm的距離內(nèi)用放大鏡觀察到的物體像的視角同沒有放大鏡觀察到的物體視角的比值。

　　（二） 顯微鏡的成像原理

　　顯微鏡和放大鏡起著同樣的作用，就是把近處的微小物體成一放大的像，以供人眼觀察。只是顯微鏡比放大鏡可以具有更高的放大率而已。

　　圖2是物體被顯微鏡成像的原理圖。圖中為方便計(jì)，把物鏡L1和目鏡L2均以單塊透鏡表示。物體AB位于物鏡前方，離開物鏡的距離大于物鏡的焦距，但小于兩倍物鏡焦距。所以，它經(jīng)物鏡以后，必然形成一個(gè)倒立的放大的實(shí)像A'B'。 A'B'位于目鏡的物方焦點(diǎn)F2上，或者在很靠近F2的位置上。再經(jīng)目鏡放大為虛像A''B''后供眼睛觀察。虛像A''B''的位置取決于F2和A'B'之間的距離，可以在無限遠(yuǎn)處（當(dāng)A'B'位于F2上時(shí)），也可以在觀察者的明視距離處（當(dāng)A'B'在圖中焦點(diǎn)F2之右邊時(shí)）。目鏡的作用與放大鏡一樣。所不同的只是眼睛通過目鏡所看到的不是物體本身，而是物體被物鏡所成的已經(jīng)放大了一次的像。

　?。ㄈ?顯微鏡的重要光學(xué)技術(shù)參數(shù)

　　在鏡檢時(shí)，人們總是希望能清晰而明亮的理想圖象，這就需要顯微鏡的各項(xiàng)光學(xué)技術(shù)參數(shù)達(dá)到一定的標(biāo)準(zhǔn)，并且要求在使用時(shí)，要根據(jù)鏡檢的目的和實(shí)際情況來協(xié)調(diào)各參數(shù)的關(guān)系。只有這樣，才能充分發(fā)揮顯微鏡應(yīng)有的性能，得到滿意的鏡檢效果。

　　顯微鏡的光學(xué)技術(shù)參數(shù)包括：數(shù)值孔徑、分辨率、放大率、焦深、視場寬度、覆蓋差、工作距離等等。這些參數(shù)并不都是越高越好，它們之間是相互聯(lián)系又相互制約的，在使用時(shí)，應(yīng)根據(jù)鏡檢的目的和實(shí)際情況來協(xié)調(diào)參數(shù)間的關(guān)系，但應(yīng)以保證分辨率為準(zhǔn)。

　　1． 數(shù)值孔徑

　　數(shù)值孔徑簡寫NA，數(shù)值孔徑是物鏡和聚光鏡的主要技術(shù)參數(shù)，是判斷兩者（尤其對物鏡而言）性能高低的重要標(biāo)志。其數(shù)值的大小，分別標(biāo)刻在物鏡和聚光鏡的外殼上。

　　數(shù)值孔徑（NA）是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質(zhì)的折射率（n）和孔徑角（u）半數(shù)的正弦之乘積。用公式表示如下：NA=nsinu/2

　　孔徑角又稱"鏡口角"，是物鏡光軸上的物體點(diǎn)與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度?？讖浇窃酱?，進(jìn)入物鏡的光通亮就越大，它與物鏡的有效直徑成正比，與焦點(diǎn)的距離成反比。

　　顯微鏡觀察時(shí)，若想增大NA值，孔徑角是無法增大的，**的辦法是增大介質(zhì)的折射率n值?；谶@一原理，就產(chǎn)生了水浸物鏡和油浸物鏡，因介質(zhì)的折射率n值大于1，NA值就能大于1。

　　數(shù)值孔徑更大值為1.4，這個(gè)數(shù)值在理論上和技術(shù)上都達(dá)到了尤限。目前，有用折射率高的溴萘作介質(zhì)，溴萘的折射率為1.66,所以NA值可大于1.4。

　　這里要指出，為了充分發(fā)揮物鏡數(shù)值孔徑的作用，在觀察時(shí)，聚光鏡的NA值應(yīng)等于或略大于物鏡的NA值。

　　數(shù)值孔徑與其他技術(shù)參數(shù)有著密切的關(guān)系，它幾乎決定和影響著其他各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)。它與分辨率成正比，與放大率成正比，與焦深成反比，NA值增大，視場寬度與工作距離都會(huì)相應(yīng)地變小。

　　2． 分辨率

　　顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區(qū)分的兩個(gè)物點(diǎn)的更小間距，又稱"鑒別率"。其計(jì)算公式是σ=λ/NA

　　式中σ為更小分辨距離；λ為光線的波長；NA為物鏡的數(shù)值孔徑?？梢娢镧R的分辨率是由物鏡的NA值與照明光源的波長兩個(gè)因素決定。NA值越大，照明光線波長越短，則σ值越小，分辨率就越高。

　　要提高分辨率，即減小σ值，可采取以下措施

　?。?） 降低波長λ值，使用短波長光源。

　　（2） 增大介質(zhì)n值以提高NA值（NA=nsinu/2）。

　　（3） 增大孔徑角u值以提高NA值。

　?。?） 增加明暗反差。

　　3． 放大率和有效放大率

　　由于經(jīng)過物鏡和目鏡的兩次放大，所以顯微鏡總的放大率Γ應(yīng)該是物鏡放大率β和目鏡放大率Γ1的乘積：

　　Γ=βΓ1

　　顯然，和放大鏡相比，顯微鏡可以具有高得多的放大率，并且通過調(diào)換不同放大率的物鏡和目鏡，能夠方便地改變顯微鏡的放大率。

　　放大率也是顯微鏡的重要參數(shù)，但也不能盲目相信放大率越高越好。顯微鏡放大倍率的尤限即有效放大倍率。

　　分辨率和放大倍率是兩個(gè)不同的但又互有聯(lián)系的概念。有關(guān)系式：500NA<Γ<1000NA

　　當(dāng)選用的物鏡數(shù)值孔徑不夠大，即分辨率不夠高時(shí)，顯微鏡不能分清物體的微細(xì)結(jié)構(gòu)，此時(shí)即使過度地增大放大倍率，得到的也只能是一個(gè)輪廓雖大但細(xì)節(jié)不清的圖像，稱為無效放大倍率。反之如果分辨率已滿足要求而放大倍率不足，則顯微鏡雖已具備分辨的能力，但因圖像太小而仍然不能被人眼清晰視見。所以為了充分發(fā)揮顯微鏡的分辨能力，應(yīng)使數(shù)值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配。

　　4． 焦深

　　焦深為焦點(diǎn)深度的簡稱，即在使用顯微鏡時(shí)，當(dāng)焦點(diǎn)對準(zhǔn)某一物體時(shí)，不僅位于該點(diǎn)平面上的各點(diǎn)都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度內(nèi)，也能看得清楚，這個(gè)清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被檢物體的全層，而焦深小，則只能看到被檢物體的一薄層，焦深與其他技術(shù)參數(shù)有以下關(guān)系：

　?。?） 焦深與總放大倍數(shù)及物鏡的數(shù)值孔徑成反比。

　　（2） 焦深大，分辨率降低。

　　由于低倍物鏡的景深較大，所以在低倍物鏡照相時(shí)造成困難。在顯微照相時(shí)將詳細(xì)介紹。

　　5． 視場直徑（Field Of View）

　　觀察顯微鏡時(shí)，所看到的明亮的圓形范圍叫視場，它的大小是由目鏡里的視場光闌決定的。

　　視場直徑也稱視場寬度，是指在顯微鏡下看到的圓形視場內(nèi)所能容納被檢物體的實(shí)際范圍。視場直徑愈大，愈便于觀察。

　　有公式 F=FN/β

　　式中F: 視場直徑，F(xiàn)N：視場數(shù)（Field Number, 簡寫為FN，標(biāo)刻在目鏡的鏡筒外側(cè)），β:物鏡放大率。

　　由公式可看出：

　?。?） 視場直徑與視場數(shù)成正比。

　?。?） 增大物鏡的倍數(shù)，則視場直徑減小。因此，若在低倍鏡下可以看到被檢物體的全貌，而換成高倍物鏡，就只能看到被檢物體的很小一部份。

　　6． 覆蓋差

　　顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)也包括蓋玻片在內(nèi)。由于蓋玻片的厚度不標(biāo)準(zhǔn)，光線從蓋玻片進(jìn)入空氣產(chǎn)生折射后的光路發(fā)生了改變，從而產(chǎn)生了相差，這就是覆蓋差。覆蓋差的產(chǎn)生影響了顯微鏡的成響質(zhì)量。

　　國際上規(guī)定，蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度為0.17mm，許可范圍在0.16-0.18mm，在物鏡的制造上已將此厚度范圍的相差計(jì)算在內(nèi)。物鏡外殼上標(biāo)的0.17，即表明該物鏡所要求的蓋玻片的厚度。

　　7． 工作距離WD

　　工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。鏡檢時(shí)，被檢物體應(yīng)處在物鏡的一倍至二倍焦距之間。因此，它與焦距是兩個(gè)概念，平時(shí)習(xí)慣所說的調(diào)焦，實(shí)際上是調(diào)節(jié)工作距離。

　　在物鏡數(shù)值孔徑一定的情況下，工作距離短孔徑角則大。

　　數(shù)值孔徑大的高倍物鏡，其工作距離小。

　?。ㄋ模?物鏡

　　物鏡是顯微鏡更重要的光學(xué)部件，利用光線使被檢物體**次成象，因而直接關(guān)系和影響成象的質(zhì)量和各項(xiàng)光學(xué)技術(shù)參數(shù)，是衡量一臺顯微鏡質(zhì)量的首要標(biāo)準(zhǔn)。

　　物鏡的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，制作精密，由于對象差的校正，金屬的物鏡筒內(nèi)由相隔一定距離并被固定的透鏡組組合而成。物鏡有許多具體的要求，如合軸,齊焦。

　　齊焦既是在鏡檢時(shí)，當(dāng)用某一倍率的物鏡觀察圖象清晰后，在轉(zhuǎn)換另一倍率的物鏡時(shí)，其成象亦應(yīng)基本清晰，而且象的中心偏離也應(yīng)該在一定的范圍內(nèi)，也就是合軸程度。齊焦性能的優(yōu)劣和合軸程度的高低是顯微鏡

　　質(zhì)量的一個(gè)重要標(biāo)志，它是與物鏡的本身質(zhì)量和物鏡轉(zhuǎn)換器的精度有關(guān)。

　　現(xiàn)代顯微物鏡已達(dá)到高度完善，其數(shù)值孔徑已接近尤限，視場中心的分辨率與理論值之區(qū)別已微乎其微。但繼續(xù)增大顯微物鏡視場與提高視場邊緣成象質(zhì)量的可能性仍然存在，這種研究工作，至今仍在進(jìn)行。

　　顯微物鏡與目鏡在參于成象這點(diǎn)上是有區(qū)別的。物鏡是顯微鏡更復(fù)雜和更重要的部分，在寬光束中工作(孔徑大)，但這些光束與光軸的傾角較小(視場小)；目鏡在窄光束中工作，但其傾角大（視場大）。當(dāng)計(jì)算物鏡與目鏡，在消除象差上有很大差別。

　　與寬光束有關(guān)的象差是球差、慧差以及位置色差；與視場有關(guān)的象差是象散、場曲、畸變以及倍率包差。

　　顯微物鏡是一消球差系統(tǒng)。這意味著：就軸上的一對共軛點(diǎn)而言，消除了球差并且實(shí)現(xiàn)了正弦條件時(shí)，每一物鏡僅有兩個(gè)這種消球差點(diǎn)。因此，物體與象的計(jì)算位置的任何改變均導(dǎo)致象差變大。

　　1． 物鏡的主要參數(shù)

　　（1） 放大率β

　?。?） 數(shù)值孔徑NA

　　（3） 機(jī)械筒長L：在顯微鏡中，物鏡支承面到目鏡支承面之間的距離稱為機(jī)械筒長。對于一臺顯微鏡來說，機(jī)械筒長是固定的。我國規(guī)定機(jī)械筒長是160毫米。

　　（4） 蓋玻片厚度d

　?。?） 工作距離WD

　　這些參數(shù)，大多刻在物鏡筒上，如圖3所示。

　　有一種所謂筒長無限的顯微物鏡，這種物鏡的后方一般帶有輔助物鏡（也叫補(bǔ)償物鏡或鏡筒物鏡），被觀察物體位于物鏡前焦點(diǎn)上，經(jīng)過物鏡以后，成像在無限遠(yuǎn)，再經(jīng)過輔助物鏡成像在輔助物鏡的焦平面上，如圖4所示。在物鏡和輔助物鏡之間是平行光，所以中間距離比較自由一些，可以加入棱鏡等光學(xué)元件。

　　2． 物鏡的基本類型

　?。?） 按顯微鏡鏡筒長度（以mm計(jì)）：透射光用160鏡筒，帶0.17mm厚或更厚的蓋玻片；反射光用190鏡筒，不帶蓋玻片；透射光與反射光用鏡筒，筒長無限大。

　?。?） 按浸法特征：非浸式(干式)、浸式(油浸、水浸、甘油浸及其它浸法)。

　?。?） 按光學(xué)裝置：透射式、反射式以及折反射式。

　?。?） 按數(shù)值孔徑和放大倍數(shù)：低倍(NA≤0.2與β≤10X)，中倍(NA≤0.65與β≤40X)，高倍(NA＞0.65與β＞40X)。

　?。?） 按校正象差的情況不同，通常分為消色差物鏡，半復(fù)消色差物鏡，復(fù)消色差物鏡，平視場消色差物鏡，平視場復(fù)消色差物鏡和單色物鏡。

　　a. 消色差物鏡（Achromatic objective）

　　這是應(yīng)用更廣泛的一類顯微物鏡，外殼上常有"Ach"字樣。它校正了軸上點(diǎn)的位置色差（紅，藍(lán)二色）、球差（黃綠光）和正弦差，保持了齊明條件。軸外點(diǎn)的象散不超過允許值(－4屬光度)，二級光譜未校正。

　　數(shù)值孔徑為0.1~0.15的低倍消色差物鏡一般由兩片透鏡膠合在一起的雙膠物鏡構(gòu)成。數(shù)值孔徑至0.2的消色差物鏡由兩組雙膠透鏡構(gòu)成。當(dāng)數(shù)值孔徑增大到0.3時(shí)，再加入一平凸透鏡，該平凸透鏡決定著物鏡的焦距，而其它透鏡則補(bǔ)償由其平面與球面產(chǎn)生的象差。高倍物鏡的平面象差可用浸法消除。高倍消色差物鏡一般均為浸式，由四部分構(gòu)成：前片透鏡、新月形透鏡及兩個(gè)雙膠透鏡組。

　　b. 復(fù)消色差物鏡（Apochromatic objective）

　　這類物鏡的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，透鏡采用了特種玻璃或螢石等材料制作而成，物鏡的外殼上標(biāo)有"Apo"字樣。它對兩個(gè)色光實(shí)現(xiàn)了正弦條件，要求嚴(yán)格地校正軸上點(diǎn)的位置色差（紅，藍(lán)二色）、球差（紅，藍(lán)二色）和正弦差，同時(shí)要求校正二級光譜（再校正綠光的位置色差）。其倍率色差并不能完全校正，一般須用目鏡補(bǔ)償。

　　由于對各種象差的校正尤為完善，比響應(yīng)倍率的消色差物鏡有更大的數(shù)值孔徑，這樣不僅分辨率高，象質(zhì)量優(yōu)而且也有更高的有效放大率。因此，復(fù)消色差物鏡的性能很高，適用于**研究鏡檢和顯微照相。

　　c. 半復(fù)消色差物鏡（Semi apochromatic objective）

　　半復(fù)消色差物鏡又稱氟石物鏡，物鏡的外殼上標(biāo)有"FL"字樣。在結(jié)構(gòu)上透鏡的數(shù)目比消色差物鏡多，比復(fù)消色差物鏡少，成象質(zhì)量上，遠(yuǎn)較消色差物鏡為好，接近于復(fù)消色差物鏡。

　　d. 平視場物鏡（Plan objective ）

　　平場物鏡是在物鏡的透鏡系統(tǒng)中增加一快半月形的厚透鏡，以達(dá)到校正場曲的缺陷，提高視場邊緣成像質(zhì)量的目的。平場物鏡的視場平坦，更適用于鏡檢和顯微照相。對于平視場消色差物鏡，其倍率色差不大，不必用特殊目鏡補(bǔ)償。而平視場復(fù)消色差物鏡，則要用目鏡來補(bǔ)償它的倍率色差。

　　e. 單色物鏡

　　這類物鏡由石英、熒石或氟化鋰制的一組單片透鏡構(gòu)成。只能在紫外線光譜區(qū)的個(gè)別區(qū)內(nèi)使用(寬度不超過20mm)，可見光譜區(qū)不能采用單色物鏡。這類物鏡均制成反射式與折反射式系統(tǒng)。主要缺點(diǎn)是相當(dāng)大一部分光束在中心被遮蔽(入瞳面積的25%)。在新型折反射系統(tǒng)中，由于采用半透明反射鏡以及物鏡的膠合結(jié)構(gòu)，使這一缺點(diǎn)大為減輕，從而可以取消反射鏡框的遮光。并且兩同軸反射鏡的殘余象差是互相補(bǔ)償?shù)?，同時(shí)用透鏡組來增大數(shù)值孔徑。若系統(tǒng)的校正滿意，孔徑達(dá)到NA=1.4時(shí)，中心遮蔽可不超過入瞳面積的4%。

　　f. 特種物鏡

　　所謂"特種物鏡"是在上述物鏡的基礎(chǔ)上，專門為達(dá)到某些特定的觀察效果而設(shè)計(jì)制造的。主要有以下幾種：

　　(a) 帶校正環(huán)物鏡（Correction collar objective）

　　在物鏡的中部裝有環(huán)裝的調(diào)節(jié)環(huán)，當(dāng)轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)節(jié)環(huán)時(shí)，可調(diào)節(jié)物鏡內(nèi)透鏡組之間的距離，從而校正由蓋玻片厚度不標(biāo)準(zhǔn)引起的覆蓋差。調(diào)節(jié)環(huán)上的刻度可從0 .11--.023,在物鏡的外殼上也標(biāo)科有此數(shù)字，表明可校正蓋玻片從0.11-0.23mm厚度之間的誤差。

　　(b) 帶虹彩光闌的物鏡（Iris diaphragm objective）

　　在物鏡鏡筒內(nèi)的上部裝有虹彩光闌，外方也可以旋轉(zhuǎn)的調(diào)節(jié)環(huán)，轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)可調(diào)節(jié)光闌孔徑的大小，這種結(jié)構(gòu)的物鏡是**的油浸物鏡，它的作用是在暗視場鏡檢時(shí)，往往由于某些原因而使照明光線進(jìn)入物鏡，使視場背景不夠黑暗，造成鏡檢質(zhì)量的下降。這時(shí)調(diào)節(jié)光闌的大小，使背景變黑，使被檢物體更明亮，增強(qiáng)鏡檢效果。

　　(c) 相襯物鏡（Phase contrast objective）

　　這種物鏡是由于相襯鏡檢術(shù)的專用物鏡，其特點(diǎn)是在物鏡的后焦平面處裝有相板。

　　(d) 無罩物鏡（No cover objective）

　　有些被檢物體，如涂抹制片等，上面不能加用蓋玻片，這樣在鏡檢時(shí)應(yīng)使用無罩物鏡，否則圖象質(zhì)量將明顯下降，特別是在高倍鏡檢時(shí)更為明顯。這種物鏡的外殼上常標(biāo)刻N(yùn)C，同時(shí)在蓋玻片厚度的位置上沒有0.17的字樣，而標(biāo)刻著"0"。

　　(e) 長工作距離物鏡

　　這種物鏡是倒置顯微鏡的專用物鏡，它是為了滿足組織培養(yǎng)，懸浮液等材料的鏡檢而設(shè)計(jì)。

　　（五） 目鏡

　　目鏡的作用是把物鏡放大的實(shí)象（中間象）再放大一級，并把物象映入觀察者的眼中，實(shí)質(zhì)上目鏡就是一個(gè)放大鏡。已知顯微鏡的分辨率能力是由物鏡的數(shù)值孔徑所決定的，而目鏡只是起放大作用。因此，對于物鏡不能分辨出的結(jié)構(gòu)，目鏡放的再大，也仍然不能分辨出。

　?。?聚光鏡

　　聚光鏡裝在載物臺的下方。小型的顯微鏡往往無聚光鏡，在使用數(shù)值孔徑0.40以上的物鏡時(shí)，則要具有聚光鏡。聚光鏡不僅可以彌補(bǔ)光量的不足和適當(dāng)改變從光源射來的光的性質(zhì)，而且將光線聚焦于被檢物體上，以得到更好的照明效果。

　　聚光鏡的的結(jié)構(gòu)有多種，同時(shí)根據(jù)物鏡數(shù)值孔徑的大小，相應(yīng)地對聚光鏡的要求也不同 。

　　1． 阿貝聚光鏡（Abbe condenser）

　　這是由德國光學(xué)大學(xué)大師恩斯特.阿貝(Ernst Abbe)設(shè)計(jì)。阿貝聚光鏡由兩片透鏡組成，有較好的聚光能力，但是在物鏡數(shù)值孔徑高于0.60時(shí)，則色差，球差就顯示出來。因此，多用于普通顯微鏡上。

　　2． 消色差聚光鏡(Achromatic aplanatic condenser )

　　這種聚光鏡又名"消球差聚光鏡"和"齊明聚光鏡"，它由一系列透鏡組成，它對色差球差的校正程度很高，能得到理想的圖象，是明場鏡檢中質(zhì)量更高的一種聚光鏡，其NA值達(dá)1.4 。因此，在**研究顯微鏡常配有此種聚光鏡。它不適用于4 X以下的低倍物鏡，否則照明光源不能充滿整個(gè)視場。

　　3． 搖出式聚光鏡（Swing out condenser）

　　在使用低倍物鏡時(shí)（如4X），由于視場大，光源所形成的光錐不能充滿真整個(gè)視場，造成視場邊緣部分黑暗，只中央部分被照亮。要使視場充滿照明，就需將聚光鏡的上透鏡從光路中搖出。

　　4． 其它聚光鏡

　　聚光鏡除上述明場使用的類型外，還有作特殊用圖的聚光鏡。如暗視場聚光鏡，相襯聚光鏡，偏光聚光鏡，微分干涉聚光鏡等，以上聚光鏡分別適用于相應(yīng)的觀察方式。

　?。ㄆ撸?照明方法

　　顯微鏡的照明方法按其照明光束的形成，可分為"透射式照明"，和"落射式照明"兩大類。前者適用于透明或半透明的被檢物體，絕大數(shù)生物顯微鏡屬于此類照明法；后者則適用于非透明的被檢物體，光源來自上方，又稱""反射式照明"。主要應(yīng)用與金相顯微鏡或熒光鏡檢法。

　　1． 透射式照明

　　生物顯微鏡多用來觀察透明標(biāo)本，需要以透射光來照明。有兩種照明方式

　　（1） 臨界照明（Critical illumination） 光源經(jīng)過聚光鏡后，成像于物平面上，如圖5所示。若忽略光能的損失，則光源像的亮度與光源本身相同，因此，這種方法相當(dāng)于在物平面上放置光源。顯然，在臨界照明中，如果光源表面亮度不均勻，或明顯地表現(xiàn)出細(xì)小的結(jié)構(gòu)，如燈絲等，那么就要嚴(yán)重影響顯微鏡觀察效果，這是臨界照明的缺點(diǎn)。其補(bǔ)救的方法是在光源的前方放置乳白和吸熱濾色片，使照明變得較為均勻和避免光源的長時(shí)間的照射而損傷被檢物體。用透射光照明時(shí)，物鏡成像光束的孔徑角，被聚光鏡像方光束的孔徑角所決定，為使物鏡的數(shù)值孔徑得到充分利用，聚光鏡應(yīng)有與物鏡相同或稍大的數(shù)值孔徑。

　?。?） 柯拉照明 臨界照明中物面光照度不均勻的缺點(diǎn)，在柯拉照明中可以消除。在光源1與聚光鏡5之間加一輔助聚光鏡2，如圖6所示?？梢?，由于不是直接把光源，而是把被光源均勻照明了的輔助聚光鏡2（也稱為柯拉鏡）成像在標(biāo)本6上，所以物鏡的視場（標(biāo)本）得到均勻的照明。

　　2． 落射式照明

　　在觀察不透明物體時(shí)，例如通過金相顯微鏡觀察金屬磨片，往往是采用從側(cè)面或者從上面加以照明的方式。此時(shí)，被觀察物體的表面上沒有蓋玻璃片，標(biāo)本像的產(chǎn)生是靠進(jìn)入物鏡的反射或散射光線。如圖7所示。

　　3． 用暗視場來觀察微粒的照明方法

　　用暗視場方法可以觀察超顯微質(zhì)點(diǎn)。所謂超顯微質(zhì)點(diǎn)，是指那些小于顯微鏡分辨尤限的微小質(zhì)點(diǎn)。暗視場照明的原理是：不使主要的照明光線進(jìn)入物鏡，能夠進(jìn)入物鏡成像的只是由微粒所散射的光線。

　　因此，在暗的背景上給出了亮的微粒的像，視場背景雖暗，但襯度（對比）很好，可以使分辨率提高。

　　暗視場照明又有單向和雙向之分

　?。?） 單向暗視場照明 圖8是單向暗視場照明示意圖。由圖可見，由照明器2發(fā)出的光線，經(jīng)不透明的標(biāo)本片1反射后，主要的光線都沒有進(jìn)入物鏡3，進(jìn)入物鏡的光線主要是由微?；蛲拱疾黄降募?xì)部所散射的光線。顯然，這種單向的暗視場照明，對觀察微粒的存在和運(yùn)動(dòng)是有效的，但對物體細(xì)節(jié)的再現(xiàn)不是有效的，即存在"失真"的現(xiàn)象。

　?。?） 雙向暗視場照明 雙向暗視場照明，可以消除單向所產(chǎn)生的失真缺點(diǎn)。在普通的三透鏡聚光鏡前面，安置一個(gè)環(huán)形光闌，如圖9即可實(shí)現(xiàn)雙向暗視場照明。在聚光鏡的更后一片與載物玻璃片之間浸以液體，而蓋玻璃片與物鏡之間是干的。于是，經(jīng)過聚光鏡的環(huán)形光束，在蓋玻璃片內(nèi)全反射而不能進(jìn)入物鏡，形成如圖中的回路。進(jìn)入物鏡的只是由標(biāo)本上的微粒所散射的光線，形成了雙向暗視場照明。

　　三、 光學(xué)顯微鏡的組成結(jié)構(gòu)

　　光學(xué)顯微鏡包括光學(xué)系統(tǒng)和機(jī)械裝置兩大部分，而數(shù)碼顯微鏡還包括數(shù)碼攝像系統(tǒng)，現(xiàn)分述如下：

　?。ㄒ唬?機(jī)械裝置

　　1． 機(jī)架 顯微鏡的主體部分，包括底座和彎臂。

　　2． 目鏡筒

　　位于機(jī)架上方，靠圓形燕尾槽與機(jī)架固定，目鏡插在其上。根據(jù)有否攝像功能，可分為雙目鏡筒和三目鏡筒；根據(jù)瞳距的調(diào)節(jié)方式不同，可分為鉸鏈?zhǔn)胶推揭剖健?/p>

　　3． 物鏡轉(zhuǎn)換器

　　它是一個(gè)旋轉(zhuǎn)圓盤，上有3～5個(gè)孔，分別裝有低倍或高倍物鏡鏡頭。轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器就可讓不同倍率的物鏡進(jìn)入工作光路。

　　4． 載物臺

　　是放置玻片的平臺，其中央具有通光孔。臺上有一個(gè)彈性的標(biāo)本夾，用來夾住載玻片。右下方有移動(dòng)手柄，使載物臺面可在XY雙方向進(jìn)行移動(dòng)。

　　5． 調(diào)焦機(jī)構(gòu)

　　利用調(diào)焦手輪可以驅(qū)動(dòng)調(diào)焦機(jī)構(gòu)，使載物臺作粗調(diào)和微調(diào)的升降運(yùn)動(dòng)，從而使被觀察物體對焦清晰成像。

　　6． 聚光器調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu) 聚光器安裝在其上，調(diào)節(jié)螺旋可以使聚光器升降，用以調(diào)節(jié)光線的強(qiáng)弱。

　?。ǘ?光學(xué)系統(tǒng)

　　1． 目鏡

　　它是插在目鏡筒頂部的鏡頭，由一組透鏡組成，可以使物鏡成倍地分辨、放大物像，例如10X、15X等。按照所能看到的視場大小，目鏡可分為視場較小的普通目鏡，和視場較大的大視場目鏡(或稱廣角目鏡)兩類。較**顯微鏡的目鏡上還裝有視度調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)，操作者可以方便快捷地對左右眼分別進(jìn)行視度調(diào)整；此外，在這些目鏡上可以加裝測量分劃板，測量分劃板的象總能清晰地調(diào)焦在標(biāo)本的焦面上；并且，為了防止目鏡被取走以及減少運(yùn)輸中被損壞的可能性，這些目鏡可以被鎖定。

　　2． 物鏡

　　它安裝在轉(zhuǎn)換器的孔上，也是由一組透鏡組成的，能夠把物體清晰地放大。物鏡上刻有放大倍數(shù)，主要有10X、40X、60X、100X等。高倍物鏡中多采用浸液物鏡，即在物鏡的下表面和標(biāo)本片的上表面之間填充折射率為1.5左右的液體（如杉木油），它能顯著的提高顯微觀察的分辨率。

　　3． 光源 有鹵素?zé)?、鎢絲燈、汞燈、熒光燈、金屬鹵化物燈等。

　　4． 聚光器

　　包括聚光鏡、孔徑光闌。聚光鏡由透鏡組成，它可以集中透射過來的光線，使更多的光能集中到被觀察的部位。孔徑光闌可控制聚光器的通光范圍，用以調(diào)節(jié)光的強(qiáng)度。

　?。ㄈ?數(shù)碼攝像系統(tǒng)

　　1． 攝像頭

　　2． 圖像采集卡

　　3． 軟件

　　4． 微機(jī)

　　四、 光學(xué)顯微鏡的分類

　　光學(xué)顯微鏡有多種分類方法：按使用目鏡的數(shù)目可分為雙目和單目顯微鏡；按圖像是否有立體感可分為立體視覺和非立體視覺顯微鏡；按觀察對像可分為生物和金相顯微鏡等；按光學(xué)原理可分為偏光、相襯和微差干涉對比顯微鏡等；按光源類型可分為普通光、熒光、紫外光、紅外光和激光顯微鏡等；按接收器類型可分為目視、數(shù)碼（攝像）顯微鏡等。常用的顯微鏡有雙目體視顯微鏡、金相顯微鏡、偏光顯微鏡、熒光顯微鏡等。

　　1． 雙目體視顯微鏡

　　雙目體視顯微鏡又稱"實(shí)體顯微鏡"或"解剖鏡"，是一種具有正象立體感地目視儀器。在生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛用于切片操作和顯微外科手術(shù)；在工業(yè)中用于微小零件和集成電路的觀測、裝配、檢查等工作。它具有如下特點(diǎn)：

　?。?） 利用雙通道光路，雙目鏡筒中的左右兩光束不是平行，而是具有一定的夾角--體視角（一般為12度--15度），為左右兩眼提供一個(gè)具有立體感的圖像。它實(shí)質(zhì)上是兩個(gè)單鏡筒顯微鏡并列放置，兩個(gè)鏡筒的光軸構(gòu)成相當(dāng)于人們用雙目觀察一個(gè)物體時(shí)所形成的視角，以此形成三維空間的立體視覺圖像。

　?。?） 象是直立的，便于操作和解剖，這是由于在目鏡下方的棱鏡把象倒轉(zhuǎn)過來的緣故。

　?。?） 雖然放大率不如常規(guī)顯微鏡，但其工作距離很長。

　?。?） 焦深大，便于觀察被檢物體的全層。

　　（5） 視場直徑大。

　　目前體視鏡的光學(xué)結(jié)構(gòu)是：由一個(gè)共用的初級物鏡，對物體成象后的兩光束被兩組中間物鏡----變焦鏡分開，并成一體視角再經(jīng)各自的目鏡成象，它的倍率變化是由改變中間鏡組之間的距離而獲得的，因此又稱為"連續(xù)變倍體視顯微鏡"（Zoom-stereo microscope）。隨著應(yīng)用的要求，目前體視鏡可選配豐富的選購附件，如熒光，照相，攝象，冷光源等等。

　　2． 金相顯微鏡

　　金相顯微鏡是專門用于觀察金屬和礦物等不透明物體金相組織的顯微鏡。這些不透明物體無法在普通的透射光顯微鏡中觀察，故金相和普通顯微鏡的主要差別在于前者以反射光，而后者以透射光照明。在金相顯微鏡中照明光束從物鏡方向射到被觀察物體表面，被物面反射后再返回物鏡成像。這種反射照明方式也廣泛用于集成電路硅片的檢測工作。

　　3． 偏光顯微鏡（Polarizing microscope）

　　偏光顯微鏡是用于研究所謂透明與不透明各向異性材料的一種顯微鏡。凡具有雙折射的物質(zhì)，在偏光顯微鏡下就能分辨的清楚，當(dāng)然這些物質(zhì)也可用染色法來進(jìn)行觀察，但有些則不可能，而要利用偏光顯微鏡。

　?。?） 偏光顯微鏡的特點(diǎn)

　　將普通光改變?yōu)槠窆膺M(jìn)行鏡檢的方法，以鑒別某一物質(zhì)是單折射（各向同行）或雙折射性（各向異性）。雙折射性是晶體的基本特性。因此，偏光顯微鏡被廣泛地應(yīng)用在礦物、化學(xué)等領(lǐng)域，在生物學(xué)和植物學(xué)也有應(yīng)用。

　?。?） 偏光顯微鏡的基本原理

　　偏光顯微鏡的原理比較復(fù)雜，在此不作過多介紹,偏光顯微鏡要具備以下附件：起偏鏡，檢偏鏡，補(bǔ)償器或相位片，專用無應(yīng)力物鏡，旋轉(zhuǎn)載物臺。

　　（3） 偏光鏡檢術(shù)的方式

　　正相鏡檢（Orthscope）:又稱無畸變鏡檢，其特點(diǎn)是使用低倍物鏡，不用伯特蘭透鏡（Bertrand Lens）, 被研究對象可直接用偏振光研究。同時(shí)為使照明孔徑變小，推開聚光鏡的上透鏡。正相鏡檢用于檢查物體的雙折射性。

　　b. 錐光鏡檢（Conoscope）：又稱干涉鏡檢，研究在偏振光干涉時(shí)產(chǎn)生的干涉圖樣，這種方法用于觀察物體的單軸或雙軸性。在該方法中，用強(qiáng)會(huì)聚偏振光束照明。

　　（4） 偏光顯微鏡在裝置上的要求

　　a. 光源：更好采用單色光，因?yàn)楣獾乃俣?，折射率，和干涉現(xiàn)象由于波長的不同而有差異。一般鏡檢可使用普通光。

　　b. 目鏡：要帶有十字線的目鏡。

　　c. 聚光鏡：為了取得平行偏光，應(yīng)使用能推出上透鏡的搖出式聚光鏡。

　　d. 伯特蘭透鏡：聚光鏡光路中的輔助部件，這是把物體所有造成的初級相放大為次級相的輔助透鏡。它可保證用目鏡來觀察在物鏡后焦平面中形成的平涉圖樣。

　?。?） 偏光鏡檢術(shù)的要求

　　a. 載物臺的中心與光軸同軸。

　　b. 起偏鏡和檢偏鏡應(yīng)處于正交位置。

　　c. 制片不宜過薄。

　　4． 熒光顯微鏡

　　熒光顯微鏡是用短波長的光線照射用熒光素染色過的被檢物體，使之受激發(fā)后而產(chǎn)生長波長的熒光，然后觀察。熒光顯微鏡廣泛應(yīng)用于生物，醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。

　?。?） 熒光顯微鏡一般分為透射和落射式兩種類型。

　　a. 透射式：激發(fā)光來自被檢物體的下方，聚光鏡為暗視野聚光鏡，使激發(fā)光不進(jìn)入物鏡，而使熒光進(jìn)入物鏡。它在低倍情況下明亮，而高倍則暗，在油浸和調(diào)中時(shí)，較難操作，尤以低倍的照明范圍難于確定，但能得到很暗的視野背景。透射式不使用于非透明的被檢物體。

　　b. 落射式：透射式目前幾乎被淘汰，新型的熒光顯微鏡多為落射式，光源來自被檢物體的上方，在光路中具有分光鏡，所以對透明和不透明的被檢物體都適用。由于物鏡起了聚光鏡的作用，不僅便于操作，而且從低倍到高倍，可以實(shí)現(xiàn)整個(gè)視場的均勻照明。

　?。?） 熒光鏡檢術(shù)的注意事項(xiàng)

　　a. 激發(fā)光長時(shí)間的照射，會(huì)發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象，因此盡可能縮短觀察時(shí)間，暫時(shí)不觀察時(shí)，應(yīng)用擋板遮蓋激發(fā)光。

　　b. 作油鏡觀察時(shí)，應(yīng)用"無熒光油"。

　　c. 熒光幾乎都較弱，應(yīng)在較暗的室內(nèi)進(jìn)行。

　　d. 電源更好裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不僅會(huì)降低汞燈的壽命，也會(huì)影響鏡檢的效果。

　　目前許多新興生物研究領(lǐng)域應(yīng)用到熒光顯微鏡，如基因原位雜交（FISH）等等。

　　5． 相襯顯微鏡（Phase contrast microscope）

　　在光學(xué)顯微鏡的發(fā)展過程中，相襯鏡檢術(shù)的發(fā)明成功，是近代顯微鏡技術(shù)中的重要成就。我們知道，人眼只能區(qū)分光波的波長（顏色）和振幅（亮度），對于無色通明的生物標(biāo)本，當(dāng)光線通過時(shí)，波長和振幅變化不大，在明場觀察時(shí)很難觀察到標(biāo)本。

　　相襯顯微鏡利用被檢物體的光程之差進(jìn)行鏡檢，也就是有效地利用光的干涉現(xiàn)象，將人眼不可分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹睿词故菬o色透明的物質(zhì)也可成為清晰可見。這大大便利了活體細(xì)胞的觀察，因此相襯鏡檢法廣泛應(yīng)用于倒置顯微鏡中。

　　相襯鏡檢法在裝置上與明場不同，有一些特殊要求：

　　a. 環(huán)狀光闌（Ring slit）: 裝在聚光鏡的下方，而與聚光鏡組合為一體---相襯聚光鏡。它是由大a. 小不同的環(huán)形光闌裝在一圓盤內(nèi)，外面標(biāo)有10X、20X、40X、100X等字樣，與相對應(yīng)倍數(shù)的物鏡配合使用。

　　b. 相板（Phase plate）: 裝在物鏡的后焦平面處，它分為兩部分，一是通過直射光的部分，為半透明的環(huán)狀，叫共軛面；另一是通過衍射光的部分，?quot；補(bǔ)償面"。有相板的物鏡稱"相襯物鏡"，外殼上常有"Ph"字樣。

　　相襯鏡檢法是一種比較復(fù)雜的鏡檢方法，想要得到好的觀察效果，顯微鏡的調(diào)試非常重要。除此之外還應(yīng)注意以下幾個(gè)方面：

　　a. 光源要強(qiáng)，全部開啟孔徑光闌；

　　b. 使用濾色片，使光波近于單色。

　　6． 微分干涉對比顯微鏡（Differential interference contrast DIC）

　　微分干涉對比鏡檢術(shù)出現(xiàn)于60年代，它不僅能觀察無色透明的物體，而且圖象呈現(xiàn)出浮雕壯的立體感，并具有相襯鏡檢術(shù)所不能達(dá)到的某些優(yōu)點(diǎn)，觀察效果更為逼真。

　?。?） 原理

　　微分干涉對比鏡檢術(shù)是利用特制的渥拉斯頓棱鏡來分解光束。分裂出來的光束的振動(dòng)方向相互垂直且強(qiáng)度相等，光束分別在距離很近的兩點(diǎn)上通過被檢物體，在相位上略有差別。由于兩光束的裂距尤小，而不出現(xiàn)重影現(xiàn)象，使圖象呈現(xiàn)出立體的三維感覺。

　　（2） 微分干涉對比鏡檢術(shù)所需的特殊部件：

　　a. 起偏鏡

　　b. 檢偏鏡

　　c. 渥拉斯頓棱鏡2 塊

　?。?） 微分干涉對比鏡檢時(shí)的注意事項(xiàng)

　　a. 因微分干涉靈敏度高，制片表面不能有污物和灰塵。

　　b. 具有雙折射性的物質(zhì)，不能達(dá)到微分干涉對比鏡檢的效果。

　　c. 倒置顯微鏡應(yīng)用微分干涉時(shí)，不能用塑料培養(yǎng)皿。

　　7． 倒置顯微鏡（Inverted microscope）

　　倒置顯微鏡是為了適應(yīng)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的組織培養(yǎng)、細(xì)胞離體培養(yǎng)、浮游生物、環(huán)境保護(hù)、食品檢驗(yàn)等顯微觀察。

　　由于上述樣品特點(diǎn)的限制，被檢物體均放置在培養(yǎng)皿（或培養(yǎng)瓶）中，這樣就要求倒置顯微鏡的物鏡和聚光鏡的工作距離很長，能直接對培養(yǎng)皿中的被檢物體進(jìn)行顯微觀察和研究。因此，物鏡、聚光鏡和光源的位置都顛倒過來，故稱為"倒置顯微鏡"。

　　由于工作距離的限制，倒置顯微鏡物鏡的更大放大率為60X。一般研究用倒置顯微鏡都配置有4X、10X、20X、及40X 相差物鏡，因?yàn)榈怪蔑@微鏡多用于無色透明的活體觀察。如果用戶有特殊需要，也可以選配其它附件，用來完成微分干涉、熒光及簡易偏光等觀察。

　　目見倒置顯微鏡廣泛應(yīng)用于patch-clamp ,transgene ICSI 等領(lǐng)域。

　　8． 數(shù)碼顯微鏡

　　數(shù)碼顯微鏡是以攝像頭（即電視攝像靶或電荷耦合器）作為接收元件的顯微鏡。在顯微鏡的實(shí)像面處裝入攝像頭取代人眼作為接收器，通過這種光電器件把光學(xué)圖像轉(zhuǎn)換成電信號的圖像，然后對之進(jìn)行尺寸檢測、顆粒計(jì)數(shù)等工作。這類顯微鏡可以與計(jì)算機(jī)聯(lián)用，這便于實(shí)現(xiàn)檢測和信息處理的自動(dòng)化，多應(yīng)用于需要進(jìn)行大量繁瑣檢測工作的場合。